La nouvelle aventure d’Indiana Jones débute dans un désert du sud-ouest des États-Unis. Nous sommes en 1957, en pleine Guerre Froide ; Indy et son copain Mac ( Ray Winstone) viennent tout juste d'échapper à une bande d'agents soviétiques à la recherche d'une mystérieuse relique surgie du fond des temps.
De retour au Marshall College, le Professeur Jones apprend une très mauvaise nouvelle : ses récentes activités l'ont rendu suspect aux yeux du gouvernement américain. Le doyen Stanforth ( Jim Broadbent), qui est aussi un proche ami, se voit contraint de le licencier.
À la sortie de la ville, Indiana fait la connaissance d'un jeune motard rebelle, Mutt ( Shia LaBeouf), qui lui fait une proposition inattendue. En échange de son aide, il le mettra sur la piste du Crâne de Cristal d'Akator, relique mystérieuse qui suscite depuis des siècles autant de fascination que de craintes. Ce serait à coup sûr la plus belle trouvaille de l'histoire de l'archéologie.
Indy et Mutt font route vers le Pérou, terre de mystères et de superstitions, où tant d'explorateurs ont trouvé la mort ou sombré dans la folie à la recherche d'hypothétiques et insaisissables trésors. Mais ils réalisent très vite qu'ils ne sont pas seuls dans leur quête : les agents soviétiques sont eux aussi à la recherche du Crâne de Cristal, car il est dit que celui qui possède le Crâne et en déchiffre les énigmes s'assure du même coup le contrôle absolu de l'Univers. Le chef de cette bande est la cruelle et somptueuse Irina Spalko ( Cate Blanchett).

Indy et Mutt réussiront-ils à semer leurs poursuivants, à déjouer les pièges de leurs faux amis, et surtout à éviter que le Crâne de Cristal ne tombe entre les mains avides d'Irina et ses sinistres sbires ?